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史俊霞

凝膠過濾色譜法是體積排阻色譜法的一種，以水或者緩沖液為流動相；以有機溶劑為流動相的一般叫凝膠滲透色譜法。

兩者都屬于體積排阻色譜法（Size exclusion chromatography，SEC）。SEC是20世紀60年代發展的一種分離模式。它是根據空間結構不同的分子在多孔顆粒中的路徑不同而進行分離。原理如下

01

原理

看完原理給我們就有了一個小的tips啦:

tips 1

分子直徑比最大孔隙直徑大的分子全部被排阻在凝膠顆粒以外，兩種或兩種以上的這樣的分子不能達到分離效果。

tips 2

分子直徑比最小孔隙直徑小的分子能全部進入凝膠顆粒內部，這樣的兩種或兩種以上的分子也不能達到分離效果。

02

應用領域

•單抗
•雙抗
•ADC
•融合蛋白
•血液制品
•重組白蛋白
•PEG蛋白
•多肽

輔料和殘留分析

•吐溫80/20
•聚乙二醇
•泊洛沙姆
•聚乙烯吡咯烷酮

食品化藥領域

•水溶性抗生素聚體分析
•乳品中乳白蛋白和乳球蛋白分離
•中藥中吐溫20/80

不同的樣品由于空間結構不同，在同一根柱子上的排阻范圍不同。參考選用跟標準品結構最相近的排阻范圍內的柱子。如下BIOBASIC系列SEC色譜柱的不同標準品的校準曲線如下：

生物藥質控

•單抗
•雙抗
•ADC
•融合蛋白
•血液制品
•重組白蛋白
•糖蛋白
•PEG蛋白
•多肽
•多糖
•纖維素

生物藥工藝監控

03

方法開發考慮因素

1、孔徑分布

300?       vs       250?

相近孔徑分布的柱子，在檢測同一個樣品時，聚體與主峰或者主峰與片段的分離可能會存在比較大的差異。

2、粒徑

(該數據來自于2020藥典四部)

5 μm      vs      10 μm

不同的粒徑的相近孔徑分布的柱子，分析需要的柱長和分析時間會有差異。

3、緩沖體系

CX-1 Buffer      vs      磷酸鹽緩沖液

緩沖體系中流動相的組成，pH值可能會改變蛋白的三維結構和折疊狀態，進而影響單體，片段與聚體的分離。

4、鹽濃度

由于包裹技術的差異，樣品可能會跟色譜柱之間存在一些離子性吸附，這個時候，需要提高流動相中鹽的濃度來屏蔽這種作用。Mabpac SEC 系列優異的包裹技術，可以在比較低的鹽濃度下分析蛋白樣品，進而用于Native 質譜方法開發。

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// 參考資料：

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[1] 2020藥典
[2]Technical Guide Biobasic SEC Columns
[3]Complete characterization of a lysine-linked antibody drug conjugate by native LC/MS intact mass analysis and peptide mapping

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