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| 銀染法端粒酶活性檢測試劑盒 型號:NKJ15DLM | 貨號: |
| 一、原理 端粒DNA與細胞的壽命密切相關，而合成又依賴于端粒酶。正常人體細胞中不能檢測出端粒酶活性的表達，而腫瘤細胞株及大多數腫瘤組織中的端粒酶活性卻異常的高表達。因此對組織或細胞中端粒酶活性的檢測具有重要意義。TRAP－銀染法端粒酶活性檢測試劑盒是采用端粒重復序列擴增的方法，利用銀染技術檢測端粒酶的活性。陽性結果在凝膠電泳上顯示相隔6 bp的梯狀條帶，條帶的深淺表示端粒酶活性的大小。TRAP-銀染法保留了傳統TRAP法靈敏度高、特異性強等優點，同時縮短了檢測所需的時間，避免了同位素的放射污染。 三、操作步驟 1． 細胞端粒酶和組織標本端粒酶的提取 （1） 用PBS洗滌細胞二次（離心2000rpm，5min）收集1~2×106細胞；若是組織標本，稱取0.5g左右的組織，用PBS洗滌后，研碎； （2） 加入1ml冰冷的Wash buffer(使用前每ml Wash buffer中加入1μL 1M的DTT)，懸浮上述樣品，置冰上5min； （3） 4oC，離心 (3,000 rpm，5min)，棄上清； （4） 加入40μL冰冷的Lysis buffer [使用前每ml Lysis buffer中加入0.5μL PMSF（100mM溶于異丙醇）和0.5μLβ-巰基乙醇（0.5M溶于水，一般市售純液體為14.3M）]，懸浮沉淀，渦旋振蕩10s，置冰上30min，其中間隔數分鐘，渦旋振蕩一次，共3-5次； （5） 4oC，離心 (13,000 rpm，30min)； （6） 把離心上清轉移至新的管中，放置冰上并測定其蛋白濃度，zui后用Lysis buffer調濃度至5～10μg/μL，于－20℃保存備用； 2． PCR擴增 （1） 吸取5μL 10×TRAP buffer，另加入1μL dNTPs，1μL Taq-DNA polymerase， 1 μL TS primer，2μL端粒酶提取物，然后加入39μL滅菌超純水，于PCR擴增儀上23 oC保溫10min； （2） 加入1μL CX primer，混勻，在擴增儀上進行27個循環，循環參數94 oC，30s；50 oC，30s；72 oC，90s；zui后72 oC延伸5min； 以下步驟的試劑需用戶自備。 3． 聚丙烯酰胺凝膠電泳 （1） 制備12％非變性聚丙烯酰胺凝膠（10ml） 30％Acr－Bis（29：1） 4 ml H2O 4.92 ml 10×TBE 1 ml 10％APS 70 μL TEMED 10 μL （2） 在電壓180V，12％非變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳預跑1hr； （3） 取9μL PCR產物加上1μL 10×上樣緩沖液，在電壓180V，12％非變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳1hr； 4． 銀染 （1） 將凝膠置10％乙酸固定30min，然后用蒸餾水漂洗3次，每次5min； （2） 將凝膠置于0.2 g/L*浸泡1min，然后用蒸餾水漂洗3次，每次30s； （3） 將凝膠置于*染液浸泡30min，然后用蒸餾水漂洗15s； （4） 將凝膠置于顯色液中顯色10min左右直到全部條帶顯色為止； （5） zui后將凝膠置于10％乙酸浸泡5min終止反應。 四、儲存 dNTPs、Taq-DNA polymerase、TS primer、CX primer－20 oC保存，其它試劑4 oC保存。 保質期：一年。 用戶自備試劑配方： 10×TBE（pH=8.3） (100mL) 10×上樣緩沖液(10mL) 10.8g Tris 25mg 溴酚蘭 5.5g 硼酸 4g 蔗糖 4ml 0.5M EDTA 定容至10mL 定容至100mL *染液(100mL) 顯色液(100mL) 0.2g * 3g 碳酸鈉 25μL 37％甲醛 25μL 37％甲醛 定容至100mL 0.4mg * 定容至100mL | 產品圖片 |
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